荷叶为睡莲科水生（Nelumbo nucifera）植物莲的叶片，是一种药食同源类植物[1]，富含多酚、黄酮、生物碱、氨基酸、矿物质、纤维素等营养成分[2-5]，药理学研究发现荷叶具有抑菌、消炎、降血脂、抗肿瘤、抗病毒等功效[6-8]。《本草纲目》记载“荷叶服之，令人瘦劣”，因此荷叶常作为降脂、瘦身等食品、药品的原材料。我国荷叶资源丰富，在浙江、湖北等地广泛分布，常作为功能性成分用于制作挂面、饼干或降脂茶[9-11]。由于其产品较为单一，利用率不高，使得大部分荷叶无人采收。近年来，随着对荷叶活性成分和药理学研究的增加，荷叶的开发利用越来越受到关注。
荷叶茶是较为常见的荷叶产品，其加工工艺主要以传统绿茶工艺进行处理或直接干燥后泡水饮用[12]，但由于荷叶中单宁[13]和槲皮素[14]等苦涩物质的影响，使得荷叶茶感官品质不佳。目前，对荷叶茶感官品质的改进主要是通过添加蜂蜜、白砂糖等苦味掩盖剂[15-16]，或是采用微波杀青改进荷叶茶加工工艺[17-18]。大曲发酵茶是以大曲作为菌种对茶进行发酵，改善茶饮品口感、风味和营养成分的一种工艺。研究显示，使用大曲作为发酵剂，对藤茶[19]、桑叶[20]进行发酵，能够有效增加茶饮品中的黄酮、多酚、氨基酸等营养成分，改善茶饮品风味。
目前，利用大曲发酵荷叶茶的研究鲜有报道。本试验以荷叶为原料，利用浓香型大曲发酵制备功能性荷叶茶，通过单因素试验和响应面-主成分分析法对功能性荷叶茶的发酵条件进行优化，以期为荷叶的加工利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荷叶：湖北荆门地区；浓香型大曲：泸州市龙马潭区瑞华生物制曲有限公司；千禾陈醋：市售；福林酚试剂（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、结晶氯化铝、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；无水碳酸钠（分析纯）：天津市广成化学试剂有限公司；奥利司他、脂肪酶：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芦丁标准品（纯度均＞98%）：昆明云科生物技术有限公司；没食子酸标准品（纯度均＞98%）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UT-1901型双光束紫外分光光度仪：北京普析通用仪器有限公司；FA224C型电子分析天平：上海力辰邦西仪器科技有限公司；BPS-100型生化培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；SB25-12D数控超声波清洗仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；101-2A电热恒温鼓风干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机：上海赵迪生物科技有限公司；SN-ERA-104G型酶标仪：上海尚普仪器设备有限公司；FTT-2500T型高速多功能粉碎机：东莞市房太电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
荷叶→预处理→盐渍→洗涤→醋蒸→放凉→洗涤→揉捻→发酵→中温烘焙→回潮、冷却→功能性荷叶茶
预处理：取无病虫害的新鲜荷叶，用清水洗净后晾干表面的水分，切成2 cm×2 cm。
盐渍：将经过预处理的荷叶片放入质量浓度2.0 g/L、水温为30 ℃的盐水中[21]浸泡20 min，浸泡过程中轻轻翻动荷叶片，使其与盐水充分接触。随后用清水进行清洗。
醋蒸：将荷叶均匀铺放在用水稀释的60 mL/L沸腾陈醋溶液的蒸锅隔篦上，持续加热至荷叶变为茶绿色为止，随后放凉15 min揭盖，用清水洗净。
揉捻：将荷叶沥干水分放入揉捻机中揉捻成圆球形。
菌种活化：按照荷叶质量取一定量的大曲和蔗糖，取适量蒸馏水进行溶解，并在32 ℃活化30 min。
发酵：将活化后的大曲与荷叶均匀混合，按照每组实验的初始糖度添加蔗糖，在对应的温度下发酵对应的时间，为使大曲中大部分酶充分作用，随后在60 ℃继续发酵12 h，结束发酵。
中温烘焙：将发酵后的荷叶均匀铺放在烘箱中，80 ℃烘焙至荷叶表面干燥、散发清香、揉搓可破裂即烘焙完成。
回潮：将烘焙完成的荷叶置于相对湿度55%～65%的洁净环境中回潮、冷却至室温，得荷叶茶密封装罐保存。
1.3.2 功能性荷叶茶发酵工艺优化试验
以功能性荷叶茶总酚含量、总黄酮含量、感官评分为考察指标，采用单一变量控制法，分别考察大曲接种量（4%、6%、8%、10%、12%），发酵时间（12 h、18 h、24 h、30 h、36 h），发酵温度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃），初始糖度（4%、6%、8%、10%、12%）对功能性荷叶茶品质的影响。
1.3.3 功能性荷叶茶发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选择大曲接种量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）和初始糖度（D）为自变量，以规范化综合得分（Y）为响应值，设计4因素3水平响应面试验对功能性荷叶茶发酵工艺进行优化。响应面试验因素与水平见表1。
表1 功能性荷叶茶发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of functional lotus leaf tea
自变量A 大曲接种量/%B 发酵时间/h C 发酵温度/℃D 初始糖度/%-1水平0 1 6 8 18 20 6 24 25 8 10 30 30 10
1.3.4 测定方法
总酚含量：采用福林酚试剂法[20]测定；总黄酮含量：按照Na（NO）2-Al（NO3）3[18]法测定。
功能性荷叶茶感官评价：参考GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》制定感官评分标准，并根据荷叶特性进行修改，具体见表2。称取功能性荷叶茶2 g，加入100 mL沸水，冲泡5 min，由10名经过感官评分培训的食品专业人员（男女各5人），从香气、汤色、口感3项进行感官评分，取10人平均分。
表2 功能性荷叶茶感官评分标准
Table 1 Sensory scoring standards of functional lotus leaf tea
项目 评分标准 得分/分香气（32分）汤色（32分）口感（36分）有明显异味、无荷叶清香有较小异味、有荷叶清香无明显异味、荷叶清香醇厚荷叶清香醇厚茶汤浑浊、无明显橙黄色茶汤较少浑浊、较淡黄色茶汤无明显浑浊、较明亮茶汤橙黄明亮有明显异物感或涩味有较少异物感或涩味口感醇和、无明显涩味或异物感口感醇和甘甜0～8 9～16 17～24 25～32 0～8 9～16 17～24 25～32 0～9 10～18 19～27 28～36
1.3.5 数据处理
对功能性荷叶茶的各指标进行了主成分分析，将特征值大于1的因子作为主成分进行提取。按以下公式分别计算功能性荷叶茶各个样品的综合得分F和规范化综合得分Z。
式中：F为综合得分，Y1、Y2为主成分的特征值，F1、F2为功能性荷叶茶的主成分1、2的得分，C为累积特征值，Z为规范化综合得分，Fmax为最大的综合得分值，Fmin为最小的综合得分值。试验过程中每个因素水平重复三次实验，Design-Expert 10.0.03软件用于进行响应面试验设计和结果分析，SPSS 19.0软件用于进行主成分分析。
2 结果与分析
2.1 功能性荷叶茶发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 大曲接种量对功能性荷叶茶品质的影响
由图1可知，随着大曲接种量的增加，功能性荷叶茶的总酚含量和总黄酮含量均呈现先升高后降低的趋势；大曲接种量为8%时，总酚含量和总黄酮含量均达到最大，为（43.32±1.12）mg/g和（22.86±0.822）mg/g。这可能是因为大曲在发酵过程中产生丰富的酶系，这些酶可能使荷叶细胞壁破裂，促进总酚和黄酮类物质的释放[24]，因此随着大曲接种量的增加，总酚和总黄酮含量逐渐增加，但随着大曲接种量的进一步增加，会导致发酵菌体数量过多，菌体间发生竞争性抑制，不利于菌体的生长代谢，使得总酚和总黄酮含量降低。随着大曲接种量的增加，功能性荷叶茶的感官评分也呈现先升高后降低的趋势，大曲接种量为8%时，功能性荷叶茶茶汤橙黄明亮，荷叶清香纯正，感官评分最高，为（91.33±2.51）分。因此选择大曲接种量为6%、8%、10%进行后续试验。
图1 大曲接种量对功能性荷叶茶品质的影响
Fig.1 Effect of Daqu inoculum on the quality of functional lotus leaf tea
2.1.2 发酵时间对功能性荷叶茶品质的影响
由图2可知，随着发酵时间的延长，功能性荷叶茶中的总黄酮、总酚含量呈现先升高后趋于平缓的趋势。总酚含量在发酵时间为30 h时最大，为（58.22±0.87）mg/g；总黄酮含量在发酵时间为24 h时最大，为（28.52±0.88）mg/g。这是由于随着发酵时间的增加，大曲中各种菌种充分生长，产生各种代谢产物及促进黄酮和多酚释放的酶类物质。但是随着发酵时间的继续增加，由于营养物质匮乏，部分菌体进入衰亡期，使得多酚和黄酮含量增加趋势减缓[25]。在试验范围内，随着发酵时间的延长，感官评分呈现先增加后降低的趋势，在发酵时间为24 h时感官评分为（90.33±2.18）分，在发酵30 h时感官评分为（90.67±1.11）分。综合感官评价和总黄酮、总酚变化趋势，选择发酵时间18 h、24 h、30 h进行后续试验。
图2 发酵时间对功能性荷叶茶品质的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of functional lotus leaf tea
2.1.3 发酵温度对功能性荷叶茶品质的影响
由图3可知，随着发酵温度的升高，功能性荷叶茶中的总酚和总黄酮随着温度的变化呈现先升高后降低的趋势。总酚含量在发酵温度30 ℃时最大，为（56.32±0.75）mg/g；总黄酮含量在发酵温度25 ℃时最大，为29.34 mg/g。当发酵温度较低时，菌种生长缓慢，代谢速率低，各种酶类释放率较低，不利于总酚和黄酮从细胞中释放；当发酵温度过高时，菌种衰老加快，次级代谢产物积累，酶活性受到抑制，不利于总酚和黄酮的释放[26]。荷叶茶感官评价先升后降，在25 ℃时感官品质最佳，为（94.33±2.78）分。因此，选择发酵温度20 ℃、25 ℃、30 ℃进行后续响应面试验。
图3 发酵温度对功能性荷叶茶品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of functional lotus leaf tea
2.1.4 初始糖度对功能性荷叶茶品质的影响
由图4可知，随着初始糖度的逐渐增大，功能性荷叶茶的总黄酮、总酚含量和感官评分均呈现先升高后降低的趋势。感官评分和总黄酮含量在初始糖度为8%时最佳，分别为（94±1.98）分和30.86 mg/g；总酚含量在初始糖度为10%时最佳，为（60.78±0.86）mg/g。随着初始糖度的增加，为微生物的生长繁殖提供充足的碳源和能源，利于菌种的生长，可促进黄酮、多酚和风味物质的释放。但是当初始糖度过高时，渗透压过高，抑制菌种生长，使发酵不完全，也不利于黄酮和多酚的释放。荷叶茶感官评分在初始糖度为8%时口感最佳。因此，在选择初始糖度为6%、8%、10%进行后续试验。
图4 初始糖度对功能性荷叶茶品质的影响
Fig.4 Effect of initial sugar contents on the quality of functional lotus leaf tea
2.2 响应曲面试验设计及结果
根据Box-Behnken试验设计原理，选择大曲接种量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）和初始糖度（D）为自变量，以功能性荷叶茶总黄酮含量（Y1）、总酚含量（Y2）、感官评价（Y3）为响应值，建立响应曲面回归模型，结果见表3。
表3 功能性荷叶茶发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process optimization of functional lotus leaf tea
试验号 A B C D Y1总黄酮含量/（mg·g-1）Y2总酚含量/（mg·g-1）Y3感官评价/分1234567891 0-1010-0111000-0-1 01-11-10000000-10000-11-11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 110-110-1-1 10000000-11000-11000 000-10-100 110-100 1000 24.02 32.45 31.89 28.13 26.81 30.15 25.32 29.75 31.31 23.01 23.97 32.42 30.25 29.98 29.44 29.36 27.38 30.21 32.31 32.58 43.14 61.67 53.17 73.41 23.87 58.99 61.28 52.92 66.45 61.94 75.33 60.78 28.9 43.13 33.26 32.11 43.72 51.57 62.54 64.01 93.96 93.15 91.78 94.17 94.50 91.67 91.38 84.70 92.45 88.87 94.11 96.87 91.20 85.98 84.74 94.47 86.40 93.67 96.90 95.00
续表
试验号 A B C D Y1总黄酮含量/（mg·g-1）Y2总酚含量/（mg·g-1）Y3感官评价/分21 22 23 24 25 26 27 28 29 01-10-001-10110 100000 000101-0100-110 11000 32.96 25.98 32.11 28.58 29.89 23.74 30.24 29.84 31.54 58.00 55.68 44.87 58.87 29.41 72.11 40.98 48.98 61.12 94.80 88.10 94.98 87.17 87.45 88.78 88.74 89.96 95.15
2.2.1 功能性荷叶茶的主成分分析
采用SPSS 19.0对功能性荷叶茶的3个考察指标总黄酮含量、总酚含量和感官评价进行主成分分析，结果见表4。由表4可知，根据累计方差贡献率＞80%的原则[27]，前两个主成分的累计贡献率为81.613%，能够满足功能性荷叶茶的品质信息。
表4 功能性荷叶茶主成分的方差贡献率及特征值
Table 4 Variance contribution rate and characteristic value of principal components of functional lotus leaf tea
主成分 特征值 方差贡献率/% 累计方差贡献率/%123 1.353 1.095 0.552 45.104 36.509 18.387 45.104 81.613 100
根据表5的特征向量绝对值大小可知，决定第一主成分的指标主要是感官评价，决定第二主成分的主要是总酚和总黄酮含量。
表5 功能性荷叶茶的指标特征向量值
Table5 Index characteristic vector values of functional lotus leaf tea
指标总黄酮含量总酚含量感官评价特征向量值第一主成分 第二主成分0.592 0.496 0.870-0.696 0.781 0.029
为了消除各个指标间单位和变异程度差异的影响，对规范化综合得分（Y）进行规范化处理，得到规范化综合得分Z后，以Z值作为响应值进行响应面分析，结果见表6。
表6 主成分得分及规范化综合得分
Table 6 Principal component score and standardized comprehensive score
序列号 第一主成分得分第二主成分得分 Y 综合得分 Z 规范化综合得分1234-0.556 46 1.032 78 0.484 99 0.883 64 0.642 40-0.223 86-0.548 29 1.310 42-0.020 21 0.470 68 0.022 80 1.074 54 0.529 89 0.719 02 0.546 46 0.951 67
续表
序列号 第一主成分得分第二主成分得分 Y 综合得分 Z 规范化综合得分567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29-0.556 28 0.361 81-0.342 16-1.085 64 0.866 82-1.108 31 0.309 40 1.660 73-0.497 84-1.083 58-1.641 54 0.031 67-1.377 87 0.528 05 1.696 07 1.439 66 1.302 40-0.970 25 0.863 24-0.666 42-1.198 65-0.748 87-0.615 20-0.248 73 1.236 54-0.937 59 0.121 75 1.272 71-0.153 00 0.260 07 1.783 86 2.300 41-0.236 19-1.441 89-0.693 79-1.091 64-1.063 34-0.102 95-0.256 20-0.122 38-0.118 77-0.509 06 0.821 18-0.996 94 0.419 99-1.365 56 2.146 74-0.839 66-0.335 97-0.042 43-0.726 84 0.254 43 0.380 18-0.668 47 0.595 42 0.185 37 1.199 99 0.812 23-0.920 12-0.909 23-1.395 57-0.458 13-0.807 59 0.177 25 0.882 67 0.742 57 0.492 13-0.168 94 0.031 17-0.180 46-1.273 31 0.546 35-0.715 60-0.287 75 0.664 45 0.257 64 0.635 70 0.684 15 0.280 13 0.767 08 0.609 09 1.000 00 0.850 61 0.183 18 0.187 38 0.000 00 0.361 17 0.226 53 0.605 97 0.877 75 0.823 77 0.727 28 0.472 59 0.549 69 0.468 15 0.047 10 0.748 17 0.261 97 0.426 81 0.793 67
2.2.2 功能性荷叶茶规范化综合得分的响应面分析
Design-Expert 10.0.03软件用于对响应面试验结果进行分析。以规范化综合得分为响应值，进行多元回归拟合，确定的回归模型方程为：Z=0.81+0.016A+0.18B+0.089C+0.17D-0.0019AB+0.015AC-0.059AD+0.093BC-0.024BD-0.14CD-0.38A2-0.029B2-0.12C2-0.14D2。由表7的方差分析结果可知，该模型P值＜0.000 1＜0.05，该模型极显著，失拟项P值=0.191 5＞0.05，差异性不显著。该模型表示规范化综合得分与其他变量之间对应关系良好，说明模型构建成功；决定系数为0.953 0，用此模型可以较好的描述和分析实验结果。由P值可知，一次项B、C、D差异显著（P＜0.05），A不显著；交互项BC差异显著（P＜0.05），CD差异极显著（P＜0.01），AB、AC、AD、BD差异不显著（P＞0.05）；二次项A2、C2、D2差异极显著（P＜0.01），B2差异不显著。根据F值大小，可知各因素对功能性荷叶茶的影响顺序为：发酵时间（B）＞初始糖度（D）＞发酵温度（C）＞大曲接种量（A）。
表7 回归模型方差分析
Table 7 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14**ABCDA B******AC AD BC BD CD A2 B2*****C2 D2 20.298 8 0.440 8 57.238 5 13.361 0 51.526 2 0.002 0 0.133 4 1.988 2 4.869 3 0.327 2 11.594 9 133.612 7 0.764 2 13.753 9 17.336 0＜0.000 1 0.517 5＜0.000 1 0.002 6＜0.000 1 0.965 4 0.720 4 0.180 4 0.044 5 0.576 4 0.004 3＜0.000 1 0.396 8 0.002 3 0.001 0****残差失拟项纯误差总离差2.002 5 0.003 1 0.403 3 0.094 2 0.363 1 0.000 013 77 0.000 9 0.014 0 0.034 3 0.002 3 0.081 7 0.941 5 0.005 4 0.096 9 0.122 2 0.098 7 0.085 2 0.013 4 2.101 2 111111111111111 4 10 4 28 0.143 0 0.003 1 0.403 3 0.094 2 0.363 1 0.000 013 77 0.000 9 0.014 0 0.034 3 0.002 3 0.081 7 0.941 5 0.005 4 0.096 9 0.122 2 0.007 0 0.008 5 0.003 4 2.538 1 0.191 5不显著
2.2.3 各因素交互作用
由图5可知，发酵温度与初始糖度的响应面坡度最为陡峭，其等高线呈半椭圆，这意味着CD交互作用极显著（P＜0.01），表明交互作用CD对响应值规范化综合得分具有较大的影响。发酵温度与发酵时间的响应曲面坡度较为陡峭，其等高线呈半椭圆，这表明着BC交互作用显著（P＜0.05），且交互作用BC对响应值规范化综合得分具有影响。这与表7方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对功能性荷叶茶品质影响的响应曲面与等高线
Fig.5 Response surfaces plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the quality of functional lotus leaf tea
2.3 验证试验
由响应面分析软件得出的最优工艺参数及指标为大曲接种量8.286%，发酵时间29.732 h，发酵温度27.312 ℃，初始糖度8.758%，此时总黄酮含量为29.768 mg/g，总酚含量为74.453 mg/g，感官评价为96.071分，规范化综合得分预测值为1.031。为方便实际操作，调整发酵工艺：大曲接种量为8%，发酵时间为30 h，发酵温度为27 ℃，初始糖度为9%，最终得到功能性荷叶茶总黄酮含量为30.17 mg/g，总酚含量为73.51 mg/g，感官评价为96.2分，与软件预测的理论值基本一致，表明响应曲面-主成分分析法可信性高，准确度好。
3 结论
以浓香型大曲为菌种对荷叶进行发酵，经响应面主成分分析的方法确定最佳发酵工艺条件为大曲接种量8%，发酵时间30 h，发酵温度27 ℃，初始糖度9%，制得的功能性荷叶茶总黄酮含量为30.17 mg/g，总酚含量为73.51 mg/g，感官评价为96.2分。
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