石榴（Punica granatum L.）是千屈菜科（Lythraceae）石榴属（Punica）落叶灌木或乔木，也被称作安石榴、树瘤、山力叶等[1-2]。其不仅口感酸甜，而且富含抗坏血酸、花青素和多酚类物质等多种营养成分[3-4]，具有改善血压、预防衰老、炎症和癌症的功效[5]，研究表明，石榴中丰富的酚类物质具有较强的抗氧化能力[6-7]。然而，目前我国对石榴的利用主要以鲜食和初级加工为主，对于深加工产品及相关研究较少[8]。
果酒主要是指以水果为原料，经过破碎、取汁、酶解等加工工艺处理经过酵母菌发酵而制成的一种低酒精度饮料酒[9]。目前，已有火龙果酒[10]、刺梨酒[11]、水蜜桃酒[12]等果酒。李涛等[13]研究了不同的发酵工艺对石榴酒香气影响结果表明，清汁发酵石榴酒香气物质含量较高，感官品质更优；吕真真等[14]探究不同制汁方式对石榴酒品质的影响结果表明，去籽制汁发酵石榴酒感官评分较高。我国石榴种植面积广阔，长期贮存易发霉变质，造成严重资源浪费[15-16]。因此，开发研制一种新型的石榴复合果酒，不仅可以丰富果酒的品类，满足消费者的需求，有助于进一步推进其产业化，提高石榴资源利用率，提升石榴加工产品的经济价值和附加值[17]。
本研究以石榴为原料，葡萄、枸杞为辅料，采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为菌种，制备石榴葡萄枸杞复合果酒，采用单因素及响应面试验对其发酵工艺条件进行优化，并检测其理化指标及抗氧化活性，以期为石榴复合果酒工艺改良和品质提升提供参考，丰富果酒种类与口味、提高营养保健价值、促进农业产业发展、推动果酒技术创新。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
石榴（品种突尼斯）、葡萄（品种红提）、干枸杞（品种红枝）：市售；白砂糖：市售；酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BV818：湖北安琪酵母股份有限公司；果胶酶（30 000 U/g）：诺维信生物技术有限公司；偏重亚硫酸钾（食品级）：天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖（食品级）：天津市北方天医化学试剂厂；碳酸钠（食品级）：天津市致远化学试剂有限公司；柠檬酸（食品级）：浙江一诺生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
JBI-250智能生化培养箱：上海剑革电子科技有限公司；XB 220A分析天平：普利赛斯（瑞士）上海天美天平仪器有限公司；YP10002电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；GL-20G-II高速冷冻离心机：Thermo Fisher SCIENTIFIC；JYLY921高速破壁料理机：九阳股份有限公司；MC 202231手持糖度计：四川成都泰华光学有限公司；pHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；T9S双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SpectraMax ABS plus酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 石榴葡萄枸杞复合果酒加工工艺流程及操作要点
原料预处理→成分调整→酶解→接种、发酵→离心、澄清→石榴葡萄枸杞复合果酒成品
操作要点：
原料预处理：挑选完整成熟、无劣变的石榴、葡萄、枸杞并用清水洗净。石榴去皮去隔膜，为防止石榴籽影响石榴酒口感，取籽粒捏碎取汁，用40目筛网过滤，得到石榴汁；枸杞沥干水分后用料理机打浆；葡萄去除果皮和籽并捏碎。将得到的石榴汁、枸杞浆和葡萄果肉按质量比8.5∶0.5∶1.0混合均匀得到待发酵液，测定待发酵液pH及可溶性固形物含量。
成分调整：加入适量白砂糖调整待发酵液可溶性固形物含量至24°Bx，用食品级碳酸钠或者柠檬酸调节pH至3.8。
酶解：在待发酵液中加入0.05%的果胶酶后在恒温水浴锅中45 ℃酶解2 h，目的是使待发酵液中的果胶等碳水化合物通过果胶酶降解转化为发酵所需的营养物质，并释放待发酵液中所含香气成分。酶解完成后将待发酵液冷却至室温，加入0.05%30mg/L的SO2抑菌并提高果酒的抗氧化能力。
接种、发酵：将0.05%的酵母菌粉加入约5 mL的5%葡萄糖溶液中，混合均匀后置于37 ℃水浴锅中水浴加热30 min，得到活化好的酵母菌液。在无菌条件下，将活化好的酵母菌接种至待发酵液中，随后放入20 ℃恒温生化培养箱中发酵。发酵过程中，每隔4 h进行摇瓶，使酵母菌与发酵液中营养物质充分接触，每隔12 h测定发酵液可溶性固形物含量并记录，当酒精度≥7%vol时终止发酵。
离心、澄清：果酒用4层纱布过滤，离心（6 000 r/min、10 min、4 ℃），在90 ℃环境下水浴加热10 min以排出气体，随后拧紧瓶盖，取出后分段冷却，得到成品。
1.3.2 石榴葡萄枸杞复合果酒发酵工艺优化
单因素试验：在上述工艺基础上，分别考察石榴∶葡萄∶枸杞质量比（9.0∶0.5∶0.5、8.5∶1.0∶0.5、8.0∶1.5∶0.5、8.0∶1.0∶1.0、7.0∶2.0∶1.0），发酵时间（48 h、54 h、60 h、66 h、72 h），初始可溶性固形物含量（20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx、28°Bx），初始pH值（3.4、3.6、3.8、4.0、4.2），酵母接种量（0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%）对石榴葡萄枸杞复合果酒感官评分和酒精度的影响。
响应面试验：根据单因素试验结果，选取初始可溶性固形物含量（A）、初始pH值（B）、酵母接种量（C）和发酵时间（D）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行4因素3水平响应面试验设计，发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process conditions optimization
因素A 初始可溶性固形物含量/°Bx B 初始pH值C 酵母接种量/%D 发酵时间/h-1水平0 1 22 3.6 0.03 54 24 3.8 0.05 60 26 4.0 0.07 66
1.3.3 理化指标检测
可溶性固形物含量的测定：采用手持糖度计；pH的测定：采用pH计；酒精度的测定：参考GB 5009.225—2023《食品安全国家标准酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》中的酒精计法[18]。
1.3.4 感官评价
本实验邀请了15位具有感官评定经验的专业人士，从色泽、形态、香气、口感4个方面对石榴葡萄枸杞复合果酒进行感官品评（满分为100分），最终评分取平均值[19]。感官评分标准见表2。
表2 石榴葡萄枸杞复合果酒感官评分标准
Table 2 Sensory score standards of pomegranate grape wolfberry compound fruit wine
项目 评价标准 评分/分色泽形态香气口感琥珀色，有光泽色泽较淡或过浓，略有光泽色泽极淡，无光泽组织均匀，无漂浮物，无沉淀组织较均匀，有少量漂浮物或沉淀组织不均匀，有明显异物香气馥郁协调，有明显石榴风味香气浓郁但不协调，有石榴风味香气淡，无明显石榴风味无香气或有明显异味具有浓郁的果酒风味，酸甜适口，口感浓厚、细腻润滑有果酒风味，酸甜适口，清爽柔和有一定果酒风味，酸味或甜味过于突出，清爽刺激有刺激性酸味或明显苦涩味，难以下咽15～20 7～14＜7 15～20 7～14＜7 15～20 10～14 5～9＜5 30～40 20～29 10～19＜10
1.3.5 数据处理
采用Excel 2019处理数据，采用Design-Expert 11.1.0软件进行数据处理并作图。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验结果
2.1.1 不同石榴、葡萄和枸杞质量比对石榴葡萄枸杞复合果酒的影响
不同石榴、葡萄和枸杞质量比对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响见图1。
图1 石榴、葡萄、枸杞质量比对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of the mass ratio of pomegranate, grape and wolfberry on the alcohol and sensory scores of pomegranate grape wolfberry compound fruit wine
由图1可知，随着石榴添加量的减少，感官评分及酒精度先升高后下降；当石榴、葡萄、枸杞质量比为8.5∶1.0∶0.5时，感官评分、酒精度达到最高值，分别为93.17分、8.05%vol，此时的石榴葡萄枸杞复合果酒酒香适宜，酸甜适中，具有浓郁石榴风味，无不良气味。因此，选择最佳石榴、葡萄和枸杞质量比为8.5∶1.0∶0.5。
2.1.2 不同发酵时间对石榴葡萄枸杞复合果酒的影响
不同发酵时间对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响见图2。由图2可知，当发酵时间为48～60 h时，感官评分逐渐增加，酒精度明显升高；当发酵时间为60 h时，酒精度及感官评分分别为8.07%vol、93.17分；当发酵时间＞60 h时，酒精度呈缓慢上升趋势，感官评分下降。因此，选择最适发酵时间为60 h。
图2 发酵时间对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory scores of pomegranate grape wolfberry compound fruit wine
2.1.3 不同初始可溶性固形物含量对石榴葡萄枸杞复合果酒的影响
不同初始可溶性固形物含量对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响见图3。
图3 初始可溶性固形物含量对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of initial soluble solids contents on the alcohol content and sensory scores of pomegranate grape wolfberry compound fruit wine
由图3可知，当初始可溶性固形物含量为20～28°Bx时，酒精度及感官评分呈先升高后下降的趋势，其原因可能是发酵液的初始可溶性固形物含量过高，酵母菌的生长被抑制[20]。当初始可溶性固形物含量分别为24°Bx、26°Bx时，感官评分、酒精度分别达最大值，为91.02分、8.67%vol。因此，选择最适初始可溶性固形物含量为24°Bx。
2.1.4 不同初始pH对石榴葡萄枸杞复合果酒的影响
不同初始pH对石榴葡萄枸杞复合果酒的酒精度和感官评分影响结果见图4。由图4可知，当初始pH为3.4～4.2时，石榴葡萄枸杞复合果酒的酒精度及感官评分呈先升高后缓慢下降的趋势，当初始pH为3.8时，感官评分、酒精度分别达最大值，为90.50分、8.13%vol。其原因是pH会影响酵母的生长速度以及产品的感官特性[21]。当pH过低或过高时，酵母的酶活性会受到抑制，从而延迟酵母的生长和繁殖，或阻碍酒精的合成；而发酵液中的pH会影响酵母菌的代谢过程，导致代谢产物的含量发生变化[22-23]。因此，选择最适初始pH为3.8。
图4 初始pH对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.4 Effect of initial pH on the alcohol content and sensory scores of pomegranate grape wolfberry compound fruit wine
2.1.5 不同酵母接种量对石榴葡萄枸杞复合果酒的影响
适当添加酵母不仅能提高酒精发酵的速度，还能刺激芳香化合物的产生[24]。不同酵母接种量对石榴葡萄枸杞复合果酒的酒精度和感官评分影响结果见图5。
图5 酵母接种量对石榴葡萄枸杞复合果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.5 Effect of yeast inoculum on the alcohol content and sensory scores of pomegranate grape wolfberry compound fruit wine
由图5可知，当酵母接种量为0.01%～0.09%时，酒精度呈缓慢上升后有所下降的趋势，而感官评分呈现出先升高后迅速下降的趋势；当酵母接种量为0.05%时，感官评分为最大值，为93.17分，酒精度为8%vol，其原因是酵母接种量增加时，发酵速度加快，发酵液中的酒精也随之增加；但酵母接种量过大时，发酵速度快，会导致底物减少不利于风味物质的形成[25]。因此，选择最佳酵母接种量为0.05%。
2.2 发酵工艺条件优化响应面试验
2.2.1 响应面分析及模型方差分析
根据单因素试验结果，以感官评分（Y）为响应值，选取初始可溶性固形物含量（A）、初始pH（B）、酵母接种量（C）、发酵时间（D）进行发酵工艺条件优化，利用响应面软件中Box-Behnken的中心组合试验设计原理，进行4因素3水平响应面优化试验。发酵工艺条件优化响应面试验设计及结果见表3。
表3 石榴葡萄枸杞复合果酒发酵工艺条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process conditions optimization of pomegranate grape wolfberry compound fruit wine
序号 A B C D 感官评分/分1234567891 0-1 1--1-1 110000-0000-11-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 11-110000-1100000000-11-110000-1-1 11-11-1-1 11000000000 110000-11-1100000000-1-1 1100000 11000000000 1100000 78 86 80 84 77 82 79 69 80 85 72 73 83 81 74 78 81 84 74 80 84 82 69 75 91 95 92 93 93
采用Design-Expert 11.1.0软件对表3数据进行二次回归方程拟合，得到感官评分（Y）对初始可溶性固形物含量（A）、初始pH值（B）、酵母接种量（C）、发酵时间（D）的多元二次回归方程：
由表4可知，回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P值=0.335＞0.05），说明模型拟合度较好。模型决定系数为R2=0.967 6，调整决定系数R2Adj=0.935 2，表明响应值94%的变化来自于所选自变量，此模型可以用作石榴葡萄枸杞复合果酒发酵工艺参数分析预测。一次项A、C、D，交互项CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项BD对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对感官评分的影响次序为：发酵时间（D）＞酵母接种量（C）＞初始可溶性固形物含量（A）＞初始pH（B）。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和1 341.25 60.75 3 65.33 234.08 4 2.25 95.8 60.75 3 65.33 234.08 4 2.25 4 9 1 6 4 9 1 6*56.25 198 225.79 355.2 558 44.88 36.08 8.8 1 386.14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 29.88 18.95 0.935 8 20.38 73.02 1.25 0.701 8 1.25 2.81 4.99 17.55 61.76 70.43 110.79 174.05＜0.000 1 0.000 7 0.349 8 0.000 5＜0.000 1 0.282 8 0.416 2 0.282 8 0.116 0 0.042 3 0.000 9＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1**********10 4 28 56.25 198 225.79 355.2 558 3.21 3.61 2.2 1.64 0.335 0
2.2.2 响应面分析
通过响应曲面的陡峭程度及等高线形状可以反映各因素间交互作用对感官评分的影响，各因素间交互作用对感官评分影响的响应曲面及等高线见图6。
图6 各因素间交互作用对石榴葡萄枸杞复合果酒感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surfaces plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory scores of pomegranate grape and wolfberry compound fruit wine
由图6可知，初始pH（B）与发酵时间（D）交互作用响应曲面坡度较陡峭，等高线接近椭圆形，对感官评分影响显著，而酵母接种量（C）与发酵时间（D）交互作用的响应曲面陡峭，等高线呈椭圆形，对感官评分有极显著影响，这与方差分析结果一致。
根据Design-Expert 11.1.0软件分析得到石榴葡萄枸杞复合果酒最佳发酵工艺条件为：初始可溶性固形物含量24.44 °Bx、初始pH 3.80、酵母接种量0.05%、发酵时间58.59 h。在此工艺条件下发酵得到的石榴葡萄枸杞复合果酒感官评分预测值为93.67分。考虑到实际操作的可行性，将最佳发酵工艺条件修正为：初始可溶性固形物含量24.5°Bx、初始pH 3.8、酵母接种量0.05%、发酵时间59 h，按照修正后发酵条件进行验证试验，所得石榴葡萄枸杞复合果酒感官评分实际值为92.43分，与预测值基本符合，表明此模型可用于石榴葡萄枸杞复合果酒发酵条件优化。
2.2.3 石榴葡萄枸杞复合果酒的理化指标检测结果
石榴葡萄枸杞复合果酒色泽呈晶红色，澄清透明，口味柔和协调，具有浓郁的石榴果香和发酵酒香；pH为3.78，可溶性固形物含量为12°Bx，酒精度为8%vol，总酚含量为12.58 mg没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/mL，总黄酮含量为260.05 mg芦丁当量（rutin equivalent，RE）/mL，总花色苷含量为50.10 mg/L，符合国家标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
2.3 石榴葡萄枸杞复合果酒的抗氧化性分析
石榴因其高抗氧化能力被认为是一种富含多酚的水果，由于其酚酸、类黄酮和其他多酚类化合物含量较高，石榴可用作多种活性氧的有效清除剂[26]。对发酵前后的石榴葡萄枸杞复合果酒的羟基自由基清除能力进行测定，发现发酵前后石榴葡萄枸杞复合果酒的羟基自由基清除能力有显著提升（P＜0.05），并且羟基自由基清除能力由原来的4.98%提升至43.08%。表明酵母菌发酵过程中发生的水解反应，使石榴葡萄枸杞复合果酒中的酚类物质增加导致其抗氧化能力提升[27]。对比发酵前后2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS+）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率发现，ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率并无显著变化（P＞0.05），发酵后的石榴葡萄枸杞复合果酒的ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率分别达到91.49%和97.75%。经测定石榴葡萄枸杞复合果酒的还原能力经发酵后有了显著提升（P＜0.05），吸光度值由2.02增加至2.28。综上所述，发酵过程石榴葡萄枸杞复合果酒的抗氧化性得到了提升。
3 结论
采用单因素试验及响应面试验确定最佳发酵工艺参数为：初始可溶性固形物含量24.5°Bx，初始pH 3.8，酵母接种量0.05%，发酵时间59 h。在此优化条件下，酒精度为8%vol，感官评分为92.43分。可溶性固形物含量为12°Bx，总酚含量为12.58 mg（GAE）mL，总黄酮含量为260.05 mg RE/mL，总花色苷含量为50.10 mg/L，发酵后的石榴葡萄枸杞复合果酒抗氧化能力增强，ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率较高，分别为91.49%、97.75%，羟基自由基清除率、吸光度值分别显著提高至43.08%、2.28。此时石榴葡萄枸杞复合果酒色泽晶红，澄清透明，酸甜适口。石榴葡萄枸杞复合果酒的研发满足了大众对果酒口感、风味和营养的要求，为解决石榴的深加工问题提供了可行方案。
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