黄酒是我国传统发酵酒之一，因其具有独特的风味，醇厚的口感，较低的酒精度及较高的营养价值深受国人喜爱[1-2]。所谓“欲酿酒，必先制曲”[3]，传统小曲中的微生物主要有酵母菌、细菌和霉菌[4-8]，其中优势酵母菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等[9-10]。酿酒酵母是黄酒发酵中最主要的产酒精酵母，也是主要的产高级醇酵母，扣囊复膜酵母和异常威克汉姆酵母为产香酵母，是黄酒发酵产香的重要菌种[11-12]。扣囊复膜酵母可以分泌淀粉酶、糖化酶、β-葡糖苷酶和酸性蛋白酶，对淀粉的糖化起到重要作用[13]。异常威克汉姆酵母具有产生酯类、醇类和有机酸类等风味物质的能力，对香气的形成具有重要的贡献[14]，尤其具有高产乙酸乙酯的能力[12]。这3种酵母菌的正常繁殖、代谢是决定黄酒品质好坏的重要因素。米根霉（Rhizopus oryzae）是酒曲中糖化能力很强的一种霉菌，其产淀粉酶、蛋白酶活力均很高，部分米根霉产还原糖和乳酸的能力也很强，米根霉对黄酒香气成分的产生有重要作用[15]。
传统黄酒经常会出现苦味重、后劲足、易“上头”等问题。其主要原因是黄酒中含有过高的高级醇，使得酒体有不愉快的异杂味，还有较强的致醉性[16-17]。黄酒中主要的高级醇有正丙醇、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇，每一种高级醇都赋予黄酒不同的香气[18]。高级醇作为酿酒酵母发酵的副产物，其含量直接影响黄酒的风味和品质[19]。不同的酿酒酵母菌株在发酵过程中代谢产高级醇的含量存在着显著差异[20]，因此低产高级醇酵母菌株的选育对黄酒品质的提高具有重要意义[21]。吴丹丽等[22]通过模拟黄酒发酵筛选出低产尿素与高级醇的酿酒酵母菌株AW001和J-16-2。汪晗等[23]通过高粱糖化液液态发酵筛选出一株低产高级醇的酿酒酵母菌株1-11J，该菌株高级醇含量比商业菌株低65.88%。
与传统小曲相比，复合微生物菌剂具有复杂度低、可控性强、稳定性好等优点[24]。本该研究以低产高级醇的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）（1∶1∶1）混合制备复合酵母菌剂。以传统小曲发酵黄酒为对照，考察复合酵母菌剂发酵黄酒理化指标、挥发性风味物质及感官品质。以期开发低产高级醇黄酒，为复合酵母菌剂在黄酒生产中的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
糯米、传统小曲：湖北某黄酒厂；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YL-1、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）P5-1、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）LL-7、米根霉（Rhizopus oryzae）AG：本实验室分离和保藏；酿酒酵母菌株HJ-1、HJ-2：由传统小曲分离鉴定得到；商用酿酒酵母AN：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
耐高温α-淀粉酶（20 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：安琪酵母股份有限公司；琼脂粉（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国默克公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、三氯乙酸、乙酸、三乙胺、四氢呋喃、氯化钠、氢氧化钠、无水乙酸钠、葡萄糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；脱脂奶粉：双城雀巢有限公司；海藻糖：日本林原有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yesat extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，蒸馏水1 L，115 ℃高压灭菌25 min；YPD固体培养基：YPD液体培养基添加2%琼脂粉。
糯米糖化液培养基：将糯米研磨成粉，按照糯米粉与水1∶3的料液比于90 ℃的水浴锅中糊化30 min，90 ℃时加入耐高温α-淀粉酶，于90 ℃条件下液化1.5 h，冷却至30～40 ℃后加入糖化酶，65 ℃糖化30 min，整个过程需要不断搅拌，冷却后即得糯米糖化液培养基。
保护剂：脱脂奶粉50 g/L，海藻糖100 g/L，蒸馏水1 L，115 ℃高压灭菌25 min。
1.2 仪器与设备
Momscook蒸锅：广东万事泰集团有限公司；DZ30-32C10低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；FD5-3T实验室真空冷冻干燥机：美国SIM公司；ZHWY-2102恒温培养振荡器、ZXDP-A42160恒温培养箱：上海智诚科技有限公司；B337765109实验室pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；7820A气相色谱仪、7890B-5977B气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪、7820A气相色谱仪、1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、Polaris 5 C18-A色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黄酒的酿造工艺流程及操作要点
糯米预处理→蒸米→摊凉→撒曲→垒窝→发酵→过滤→成品
操作要点：糯米洗净后用凉水浸泡12 h，沥干水分后于蒸锅中均匀铺开，蒸煮20～30 min，蒸至糯米外硬内软，无夹心，疏松不糊，熟透均匀，呈柔和的亮色。蒸熟的糯米出锅后翻动冷却至20～30 ℃，用凉白开将糯米拌开，避免粘结成团影响发酵。按照0.5%的添加量接种传统小曲，搅拌均匀，将搅拌好的糯米放入器物中压实，从中间挖一个碗口粗见底的窝，用于透气和下洑水，盖上盖子放入28 ℃恒温培养箱静置培养7 d，温度调节为20 ℃继续发酵30 d，待发酵液由透明变成米白色再变成淡黄色，由浑浊变澄清，整个发酵液处于静止状态，不再冒泡，米粒不再上下窜动时发酵结束，发酵结束后用300目纱布挤压过滤，所得液体即为黄酒[25-26]。
1.3.2 低产高级醇酿酒酵母的筛选
种子液制备：将实验室冻干保藏的菌株（菌株YL-1、菌株HJ-1、菌株HJ-2、菌株AN）接种于YPD固体培养基，放入28 ℃恒温培养箱中培养2 d，在YPD固体培养基挑取酿酒酵母单个菌落，分别接种于100 mL YPD液体培养基中，恒温振荡培养（28 ℃、170 r/min）24 h。
糯米糖化液液态发酵：将种子液以5%的体积比接种至糯米糖化液，28 ℃发酵2 d，20 ℃发酵3 d，将发酵好的糯米糖化液用300目纱布挤压过滤，滤出液用蒸馏水稀释一倍经圆底烧瓶煮沸和直型冷凝管冷凝后得到馏出液，采用气相色谱检测馏出液的高级醇含量，从中筛选出高级醇含量最低的酿酒酵母菌株。
1.3.3 复合酵母菌剂的制备
筛选酵母菌剂的制备：分别将筛选酿酒酵母接种至YPD液体培养基，恒温振荡培养（培养条件为28℃、170r/min）24 h。培养结束后按2%体积比接种至5 L发酵罐中发酵（25 ℃、250 r/min）24 h，离心（4 000 r/min、10 min）去上清，将收集的菌体与保护剂，混合均匀，保护剂与无菌水的比例为1∶2，倒入培养皿中，置于-80 ℃冰箱冷冻24 h后真空冷冻干燥24 h，将干燥好的粉末状菌剂装袋，4 ℃冰箱保存备用。
复合酵母菌剂的制备：参考王奇盛等[27]酵母菌混合发酵工艺配制复合酵母菌剂，米根霉占总量的80%，酵母菌占总量的20%，3种酵母菌剂（酿酒酵母YL-1、扣囊复膜酵母P5-1、异常威克汉姆酵母LL-7）按照酵母活菌数1∶1∶1进行调配，即得复合酵母菌剂。
1.3.4 复合酵母菌剂对黄酒品质的影响
以传统小曲发酵黄酒为对照，在黄酒酿造工艺流程基础上，接种复合酵母菌剂0.5%制备黄酒，分别考察其理化性质、挥发性风味物质、氨基酸含量和感官品质。
1.3.5 分析检测
（1）还原糖和总酸的测定
还原糖的测定：参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》[28]；总酸的测定：参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[29]。
（2）发酵液中高级醇含量的测定
采用气相色谱法测定发酵液中高级醇含量[30-31]。气相色谱条件：色谱柱为DB-FFAP（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氮气（N2），进样量1μL，分流比10∶1，氢气流速为30mL/min，氮气流速为1 mL/min，空气流速为400 mL/min，进样口温度220 ℃，检测器温度200 ℃，升温程序为初始温度60 ℃维持5 min，以10 ℃/min的速率上升至160 ℃维持5 min，总运行时间20 min。
（3）挥发性风味物质的测定
采用气相色谱-质谱联用法测定挥发性风味物质含量[32]，参考国标GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[33]及汪晗等[23]的方法。气相色谱条件：进样口温度250 ℃；载气为氦气（He），流速2 mL/min，不分流；升温程序为50 ℃保持2 min，以4 ℃/min的速率升至230 ℃，保持15 min。质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃，全扫描模式，扫描范围35～350 m/z。
定性定量方法：样品中挥发性物质采用双内标法进行定量，保留时间在丙酸辛酯之前的物质以丙酸辛酯为内标，保留时间在丙酸辛酯之后的物质以L-薄荷醇为内标。待测物峰面积采用选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）模式进行积分，积分结果代入标准曲线回归方程，得到化合物最终浓度。
气味活性值（odor activity value，OAV）代表单一的香气成分对整体香气的贡献程度，OAV=物质的含量/阈值[34]。OAV＞1的成分对总体风味有直接影响，0.1＜OAV＜1对整体风味起辅助作用[35]。
（4）氨基酸的测定
采用高效液相色谱法[36]的测定氨基酸含量。液相色谱条件：Polaris 5 C18-A色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A：超纯水；流动相B：甲醇；流动相C：无水乙酸钠4.52 g，甲醇400 mL，乙腈400 mL，加入甲醇乙腈之前用3 mol/L乙酸调节pH为7.2；流动相D：无水乙酸钠4.52 g，三乙胺200 μL，四氢呋喃5 mL，用3 mol/L乙酸调节pH为7.2；流速1.0 mL/min；检测波长338 nm；柱温40 ℃；进样量10 μL。
1.3.6 感官评分标准
感官评价参考国家标准GB/T 13662—2018《黄酒》[26]。8名经过感官培训品酒员对制得的酒样从澄清度、色泽、香气、口感4个方面进行感官评价，满分为100分，黄酒感官评分标准见表1。
表1 黄酒感官评分标准
Table 1 Sensory score standards of Huangjiu
类别项目 评分标准 感官评分/分澄清度（15分）色泽（15分）香气（20分）口感（50分）无沉淀、悬浮物，澄清透明略有沉淀和悬浮物、较透明有少量沉淀，略微浑浊清亮透明、有光泽，色泽均匀色泽较差，色泽过深或过浅乳浊失光具有黄酒香气，清香醇郁黄酒香气不明显，无异香缺乏黄酒香气，有异香醇厚柔和，酸甜适宜，酒体协调口感较柔和，黄酒风格不明显，酒体较协调黄酒风格缺失，酒体不协调11～15 7～10 0～6 11～15 7～10 0～6 16～20 10～15 0～9 45～50 30～44 0～29
1.3.7 数据处理
实验数据采用WPS Excel 2023软件制表进行分析，试验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示；通过SPSS 26.0软件分析不同样本间是否存在显著性差异，对数据进行单因素方差分析，假设样本间方差相等，若Tukey HSD检验P＞0.05则无显著性差异，P＜0.05则呈显著性差异；采用Origin 2018软件进行绘图分析。
2 结果与分析
2.1 不同酿酒酵母菌株产高级醇含量的比较
将4株酿酒酵母分别接种于糯米糖化液进行液态发酵，酿酒酵母菌株液态发酵产高级醇含量的检测结果见表2。
表2 酿酒酵母菌株液态发酵产高级醇含量的检测结果
Table 2 Detection results of higher alcohols contents produced by liquid-state fermentation with Saccharomyces cerevisiae strains
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
菌株 酒精度/%vol 异丁醇/（mg·L-1） 异戊醇/（mg·L-1） β-苯乙醇/（mg·L-1） 高级醇/（mg·L-1）YL-1 HJ-1 HJ-2 AN 6.31±0.13b 6.25±0.08b 6.27±0.28b 6.68±0.11a 32.05±1.34b 36.28±1.02ab 35.47±2.16ab 40.03±2.78a 129.77±1.18d 141.36±3.02c 151.78±1.17b 158.74±2.21a 40.26±1.47c 51.53±1.79ab 48.53±2.08b 53.85±2.05a 202.08±3.99c 229.17±5.84b 235.78±5.41b 252.62±7.04a
由表2可知，产高级醇酿酒酵母菌株的顺序为菌株YL-1＜菌株HJ-1＜菌株HJ-2＜菌株AN，高级醇含量为202.08～252.62 mg/L。菌株YL-1液态发酵时产高级醇含量最低（P＜0.05），为202.08 mg/L，比商业酿酒酵母菌株AN低20%，比从黄酒小曲中分离的酿酒酵母HJ-1和HJ-2分别降低12%、14%。菌株YL-1的酒精度为6.31%vol，与其他3株酿酒酵母相近。且其代谢产异戊醇和β-苯乙醇含量均显著低于其他组（P＜0.05）。因此，选用菌株YL-1作为低产高级醇的酿酒酵母进行后续研究。
2.2 不同黄酒理化指标分析
传统小曲与复合酵母菌剂发酵黄酒的理化指标检测结果见图1。由图1可知，复合酵母菌剂发酵黄酒的酒精度达13.39%vol，与传统小曲黄酒相似。复合酵母菌剂发酵黄酒总酸、pH分别为7.72 g/L、4.43，与传统小曲黄酒含量相差不大。复合酵母菌剂发酵黄酒的总糖含量为301.54 g/L，比传统小曲黄酒高7.5%，这与复合酵母菌剂中添加了糖化能力强的米根霉有关[15]。表明复合酵母菌剂比传统小曲具有更好的糖化能力。
图1 传统小曲发酵黄酒与复合酵母菌剂发酵黄酒的理化指标
Fig.1 Physicochemical indexes of Huangjiu fermented by traditional Xiaoqu and compound yeast agents
2.3 不同黄酒挥发性风味物质分析
不同黄酒样品中挥发性物质含量检测结果及气味活性值见表3。由表3可知，传统小曲发酵黄酒共检测出83种挥发性风味物质，其中酯类34种、醇类18种、酸类16种、醛酮类11种、其他类化合物4种。复合酵母菌剂发酵黄酒共检测出87种挥发性风味物质，其中酯类35种，醇类18种，酸类16种，醛酮类14种，其他类化合物4种。与传统小曲发酵黄酒样品相比，复合酵母菌剂发酵黄酒样品增加5种挥发性风味物质，为异戊酸乙酯、3-甲硫基丙醛、糠醛、5-甲基糠醛和2,3-丁二酮，减少的1种物质为壬醛。异戊酸乙酯有类似苹果、香蕉、梨、桃、葡萄等水果的清新、鲜美的气味[37]。3-甲硫基丙醛有烤土豆、酱香味[38]。糠醛在酒中可以促进香味物质的形成和转化、调节酒液的酸度、增加酯类含量，从而提高酒的风味和口感，有杏仁味，焦香糊香味[39]。5-甲基糠醛具有持久的焦糖和水果香味[40]。2,3-丁二酮又称双乙酰，稀溶液呈现出奶油、酸奶的气味，与其他香味成分配合，起协调香味的作用[41]。壬醛带有明显的青草味和腥味[42]。
表3 不同黄酒样品中挥发性物质含量与气味活性值
Table 3 Volatile substance contents in different Huangjiu samples and odor activity values
种类 化合物 气味阈值/（μg·L-1）12 264 15 2 700 922 20 18 3 1 830 30 27-14 85 000 220 5 250 5 1 400酯类--1 200-1 890-200 000 13 000 1 000-250 500 2 820 500 9 1 500--醇类乙酸乙酯异丁酸乙酯乙酸丙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯2-甲基丁酸乙酯异戊酸乙酯乙酸丁酯乙酸异戊酯戊酸乙酯乙酸戊酯己酸乙酯丙酮酸乙酯庚酸乙酯己酸异丁酯辛酸乙酯己酸异戊酯3-羟基丁酸乙酯己酸戊酯壬酸乙酯乳酸异戊酯己酸己酯反式-4-癸烯酸乙酯琥珀酸二乙酯γ-己内酯十一酸乙酯甲酸苯乙酯乙酸苯乙酯十二酸乙酯丙位辛内酯十四酸乙酯葫芦巴内酯十六酸乙酯二氢茉莉酮酸甲酯柠檬酸三乙酯小计正丙醇异丁醇异戊醇β-苯乙醇正丁醇活性戊醇正戊醇2-庚醇3-甲基-1-戊醇正己醇306 000 40 000 30 000 10 000 150 000 24 000 6 400 250 1 100 8 000传统小曲含量/（μg·L-1）43 380.00±14.14 40.93±1.31 131.49±2.10 240.10±0.14 299.45±0.77 112.99±4.23 nd 3.40±0.22 239.93±0.11 13.25±0.35 0.81±0.01 90.77±1.09 10.58±0.82 14.89±0.16 6.91±0.13 319.49±0.72 14.11±0.15 39.78±0.32 17.17±0.24 30.93±2.11 54.82±3.25 42.90±2.15 24.73±0.39 2 101.71±2.41 23.73±0.39 29.58±0.62 1.67±0.04 44.65±3.54 50.04±6.06 1.25±0.11 191.03±1.45 490.36±4.53 1 641.74±2.46 12.08±0.11 16.97±0.04 49 734.19±20.21 80 020.00±28.28 215 947.50±24.75 149 585.00±21.21 51 537.50±10.61 701.13±1.59 95.66±0.93 55.99±0.02 30.51±0.72 5.03±0.04 202.66±3.76 OAV 3.54 2.73 0.05 0.26 14.97 6.28-0 8 0.49-6.48 0 0.07 0 63.9 0.01--0.03-0.02-0.01 0 0.03-0.18 0.1 0 0.38 54.48 1.09--0.26 5.4 4.99 5.15 00 0.01 0.12 0 0.03复合酵母菌剂含量/（μg·L-1） OAV 241 046.68±66.01 166.11±1.57 62.78±3.13 271.62±2.29 447.71±3.24 131.58±2.23 0.98±0.17 3.84±0.23 248.14±2.77 8.16±0.22 0.41±0.07 81.83±4.49 10.29±0.58 11.67±0.18 6.64±0.44 288.55±9.54 14.47±0.74 50.88±1.24 16.18±1.67 19.19±1.68 38.93±1.52 43.89±1.58 23.51±0.86 902.53±3.58 35.33±0.94 30.06±1.61 1.54±0.13 112.26±2.39 51.18±1.85 0.43±0.11 257.22±9.22 291.82±4.04 2 781.89±15.07 5.25±0.96 28.27±3.24 247 491.78±43.28 76 769.91±32.18 168 202.75±38.54 136 730.75±48.44 36 446.07±56.02 592.54±10.56 59.26±1.22 57.55±3.47 25.58±0.45 6.28±0.11 179.17±3.25 19.65 11.07 0.02 0.29 22.39 7.31 0.33 0 8.27 0.3-5.84 0 0.05 0 57.71 0.01--0.02-0.02-0 0 0.03-0.45 0.1 0 0.51 32.42 1.85--0.25 4.21 4.56 3.64 00 0.01 0.1 0.01 0.02
续表
注：“-”表示无法计算；“nd”表示未检出。
种类 化合物 气味阈值/（μg·L-1）-40 2 500 25 800 668 000 2 000 10酸类200 000 2 300 173 33.4 3 000-144 420 3 000 500 3 560 15 000--10 000 10 000醛酮类120 9.1 18 10 14 100 10 20 000 5 35 784 60 100 150 000-0.05 60-其他二异丁基甲醇蘑菇醇正庚醇芳樟醇正辛醇2,3-丁二醇糠醇3-甲硫基丙醇小计乙酸异丁酸丁酸3-甲基丁酸戊酸3-甲基戊酸4-甲基戊酸己酸庚酸辛酸壬酸正癸酸9-癸烯酸苯甲酸月桂酸十四酸小计异戊醛己醛壬醛3-甲硫基丙醛糠醛癸醛5-甲基糠醛苯乙醛5-羟甲基糠醛香草醛2,3-丁二酮乙偶姻环己酮β-大马酮香叶基丙酮小计2-正戊基呋喃2-乙酰基呋喃4-乙基-2-甲氧基苯酚二甲基三硫小计80 000 33 0.2传统小曲含量/（μg·L-1）0.68±0.03 11.99±0.02 3.09±0.13 37.08±0.12 8.62±0.17 301.02±1.45 694.12±1.28 265.16±0.22 499 502.71±34.2 385 619±12.73 29 005.64±7.92 2 684.81±21.48 4 724.76±0.34 430.14±0.15 309.41±0.84 380.61±0.87 1 039.71±0.42 13.92±0.11 125.73±1.03 17.87±0.19 125.73±1.03 10.28±0.39 240.92±1.27 46.53±0.75 87.79±0.29 810 481.74±52.7 241.85±2.61 390.98±1.38 0.78±0.03 nd nd 13.07±0.12 nd 64.65±0.49 26.37±0.52 432.14±2.97 nd 12 946.75±75.31 0.30±0.01 0.49±0.01 8.16±0.22 14 125.50±41.91 41.39±1.96 10.24±0.34 24.83±0.24 1.27±0.04 77.73±11.24 OAV-0.3 0 1.48 0.01 0 0.35 26.52 1.93 12.61 15.52 141.46 0.14-2.64 2.48 0 0.25 0.01 0.01-- 0 0.01 2.02 42.96 0.04 00 1.31 0 12.93 0 7.2 0 0.09-9.8 0.14-0 0.75 6.36复合酵母菌剂含量/（μg·L-1） OAV 0.76±0.12 19.28±1.02 2.97±0.05 10.46±0.76 6.94±0.51 199.12±1.38 596.07±5.75 181.03±2.13 420 086.99±45.85 59 687.65±60.06 4 680.63±6.18 2 571.16±9.67 5 070.24±6.14 421.75±1.77 310.82±3.43 50.26±1.94 1 141.91±5.47 15.64±1.27 221.24±3.29 16.12±2.44 220.91±4.06 23.14±2.63 164.51±6.31 60.05±1.84 87.26±2.64 134 430.94±49.71 1 103.75±5.31 256.49±2.11 nd 5.58±0.06 1 309.07±9.09 14.11±1.26 15.39±0.55 232.46±3.48 54.06±3.85 716.81±5.16 901.38±1.66 9 691.87±11.50 0.62±0.14 0.45±0.02 7.22±0.44 14 309.20±35.15 28.85±1.63 11.28±1.03 7.19±0.93 1.89±0.16 49.21±21.88-0.48 0 0.42 0.01 0 0.3 18.1 0.3 2.04 14.86 151.8 0.14-0.35 2.72 0.01 0.44 0 0.01--0.01 0.01 9.2 28.19 0 0.56 0.09 1.41 0 46.49 0 11.95 9.01 0.06-8.05 0.12-0 0.22 31.82
酯类物质是一类具有芳香性气味的化合物，多呈现果香、花香，是形成酒体香气浓郁的主要因素[43]。由表3可知，含量较高的酯类物质主要为乙酯，如乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯、十六酸乙酯，其中乙酸乙酯含量最高。复合酵母菌剂发酵黄酒样品的酯类物质总含量为247 491.78 μg/L，约为传统小曲黄酒样品的5倍，这与复合酵母菌剂选用高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母LL-7有关[44]。这表明复合酵母菌剂比传统小曲具有更好的产酯能力。
大多数醇类化合物是酵母通过Ehrlich途径和糖代谢产生的氨基酸代谢产物[45]。由表3可知，发酵的黄酒样品中含量较高的醇类物质包括正丙醇、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇。由氨基酸分解脱氨产生的高级醇基本上都呈苦味，其中异丁醇极苦，正丙醇的苦味较重，异戊醇微带甜苦[46]。与传统小曲黄酒相比，复合酵母菌剂发酵黄酒样品的正丙醇、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇的含量分别降低4.1%、22.1%、8.6%和29.3%。复合酵母菌剂发酵黄酒样品总的高级醇含量为420 086.99 μg/L，比传统小曲黄酒降低了15.9%。其原因可能与选用低产高级醇的酿酒酵母YL-1菌株有关[47]。表明复合酵母菌剂比传统小曲具有更好的降低高级醇的能力。
酸类物质在酒中起平衡风味和香气的作用[48]。适量脂肪酸可产生奶油味，而过量的脂肪酸则会产生酸臭味[49]。由表3可知，黄酒样品中乙酸含量最高，传统小曲黄酒和复合酵母菌剂的乙酸含量分别为385 619 μg/L和596 87.65 μg/L，传统小曲黄酒乙酸含量约为复合酵母菌剂发酵黄酒样品的6.5倍。除乙酸外，黄酒样品中含量较高的酸类物质还包括异丁酸、丁酸、3-甲基丁酸和己酸。挥发性酸类物质含量高，导致了传统小曲黄酒的酸味过重。
在发酵过程中，氨基酸在酶的催化作用下，代谢生成醛酮类物质[50]。醛酮类化合物与其他化合物结合，会产生奇妙的芳香，有助于增强香气的复杂性和平衡性[49]。传统小曲黄酒与复合酵母菌剂发酵黄酒的醛酮类物质总含量分别为14 125.50 μg/L、14 309.20 μg/L，两者含量相差不大。
由表3可知，OAV＞1的挥发性风味物质在传统小曲黄酒样品中有27种，复合酵母菌剂发酵黄酒样品中有25种。芳樟醇、乙酸和4-甲基戊酸是传统小曲黄酒OAV＞1的特有挥发性风味物质，2,3-丁二酮是复合酵母菌剂发酵黄酒OAV＞1的特有挥发性风味物质。OAV含量最高的为3-甲基丁酸。传统小曲黄酒和复合酵母菌剂发酵黄酒共有的OAV＞1的挥发性物质有24种，其中，OAV较大的物质分别为：乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、葫芦巴内酯、3-甲硫基丙醇、丁酸、3-甲基丁酸、异戊醛、己醛、苯乙醛。乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯等都是酒中重要的酯类物质，对酒体的香味有很大贡献。由此可见，黄酒样品中对风味贡献最多的物质为酯类化合物，其次为醇类、酸类、醛酮类和其他类化合物。
2.4 不同黄酒氨基酸含量分析
黄酒中含有大量氨基酸，氨基酸作为营养物质之一，参与蛋白质合成、机体新陈代谢，具有提高人体免疫力，影响人们的学习记忆，为人体供能等功能[51]。其中赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸为人体必需氨基酸[52]。因传统小曲黄酒苦味较重，后仅就黄酒苦味氨基酸进行分析。呈苦味的氨基酸有组氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸[53-54]等。不同黄酒样品中氨基酸含量检测结果见表4。由表4可知，传统小曲和复合酵母菌剂发酵黄酒样品中分别检测出20种、18种游离氨基酸。复合酵母菌剂发酵黄酒氨基酸总量为203 2.94 mg/L，比传统小曲发酵黄酒氨基酸含量降低31.3%。其中，8种苦味氨基酸含量比传统小曲发酵黄酒降低33.1%，这与感官评价中传统小曲发酵黄酒苦味重于复合酵母菌剂发酵黄酒的结果相一致。
表4 不同黄酒样品中氨基酸含量检测结果
Table 4 Determination results of amino acid contents in different Huangjiu samples mg/L
注：“*”表示苦味氨基酸，“nd”表示未检出。
氨基酸传统小曲 复合酵母菌剂天冬氨酸谷氨酸天冬酰胺丝氨酸谷氨酰胺甘氨酸苏氨酸丙氨酸γ-氨基丁酸半胱氨酸蛋氨酸色氨酸组氨酸*精氨酸*酪氨酸*缬氨酸*苯丙氨酸*异亮氨酸*亮氨酸*赖氨酸*苦味氨基酸总氨基酸101.43±1.43 113.30±5.42 15.83±2.21 82.75±9.35 95.79±5.13 65.41±1.14 13.28±1.81 185.92±9.76 60.39±9.29 469.58±2.23 56.62±2.29 20.36±0.76 13.35±1.36 255.22±5.38 139.22±7.38 133.98±4.27 346.46±7.02 79.71±3.92 309.59±8.61 111.74±4.08 1 389.27±15.17 2 669.92±34.08 35.65±1.54 65.52±6.33 61.88±9.11 48.44±1.83 58.56±2.73 24.28±1.95 nd 136.66±8.97 31.16±0.41 457.15±5.68 51.32±5.83 18.75±2.94 nd 125.07±6.98 127.23±9.57 118.13±3.36 308.41±9.75 59.61±1.91 258.26±8.87 46.87±4.57 1 043.58±13.89 2 032.94±29.66
2.5 不同黄酒感官评分分析
按照蒸饭拌曲的黄酒生产工艺进行实验室规模的黄酒发酵试验，传统小曲与复合酵母菌剂发酵黄酒的感官评分见表5。由表5可知，复合酵母菌剂发酵黄酒在澄清度、色泽、香气和口感方面均优于传统小曲发酵黄酒，感官评分总分为75分左右，比传统小曲发酵黄酒高17%。复合酵母菌剂发酵的黄酒清澈透亮、香气幽雅、口感酸甜，而传统小曲发酵黄酒酒体较为浑浊、香气略有异杂、口感略微酸苦，该品尝结果与上述理化性质、挥发性物质含量和氨基酸含量结果相一致。与传统小曲发酵黄酒相比，复合酵母菌剂发酵黄酒糖度更高，酯香味更浓，高级醇含量、挥发性酸含量和苦味氨基酸含量更低。
表5 传统小曲与复合酵母菌剂发酵黄酒的感官评分
Table 5 Sensory score of Huangjiu fermented by traditional Xiaoqu and compound yeast agents
样品 澄清度/分 色泽/分 香气/分 口感/分 总分/分传统小曲复合酵母菌剂12.15±0.35 13.15±0.49 12.25±1.06 12.30±0.85 15.15±0.49 16.85±0.64 36.00±1.41 39.05±1.34 75.55±3.32 81.35±2.05
3 结论
本研究以低产高级醇的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）（1∶1∶1）混合制备复合酵母菌剂。以传统小曲发酵黄酒为对照，考察复合酵母菌剂发酵黄酒理化指标、挥发性风味物质及感官品质。结果表明，与传统小曲发酵黄酒相比，复合酵母菌剂发酵黄酒酒精度无明显差异，达13.66%vol，而总糖含量（301.54 g/L）提高7.5%；增加了5种挥发性风味物质，分别为异戊酸乙酯、3-甲硫基丙醛、糠醛、5-甲基糠醛和2,3-丁二酮；酯类物质总含量（247 491.78 μg/L）提高了5倍，总高级醇含量（420 086.99 μg/L）降低了15.9%，苦味氨基酸含量降低了33.1%，感官评分（75分）提高了17%。因此，复合酵母菌剂的应用为降低黄酒中高级醇的含量、提高黄酒的口感和醇香度等提供了新的技术途径。
[1]严文怡，杨艳，谢雅婷，等.传统黄酒风味物质研究进展[J].食品安全质量检测学报，2023，14（14）：115-124.
[2]王焕宇，郑柳萍.我国传统酿酒工艺发展路径及其教育价值探析[J].化学教育（中英文），2023，44（17）：121-125.
[3]周义凡.明清酒类消费文化变迁研究[D].重庆：西南大学，2023.
[4]夏迪，谭旭，王丽，等.黄酒优势微生物对其品质和挥发性风味物质的影响[C]//中国食品科学技术学会.中国食品科学技术学会第二十届年会论文摘要集.湖南：湖南农业大学食品科学技术学院，2023：1.
[5]王玉荣，李文鹏，蔡文超，等.基于宏基因组分箱方法揭示房县黄酒加工用小曲中微生物多样性[J].食品与发酵工业，2023，49（12）：209-214.
[6]LIU Z B, WANG Z Y, LV X C, et al.Comparison study of the volatile profiles and microbial communities of Wuyi Qu and Gutian Qu,two major types of traditional fermentation starters of Hong Qu glutinous rice wine[J].Food Microbiol,2018,69:105-115.
[7]PENG Q, CHEN X P, ZHENG H J, et al.Spatial and temporal distribution of environmental microbiota in Chinese rice wine(Huangjiu)natural fermentation wineries[J].Food Biosci,2023,55:102929.
[8]YU H Y, LI Q W, GUO W, et al.Dynamic analysis of volatile metabolites and microbial community and their correlations during the fermentation process of traditional Huangjiu(Chinese rice wine)produced around Winter Solstice[J].Food Chem,2023,18:100620.
[9]YAN Y,SUN L P,XING X,et al.microbial succession and exploration of higher alcohols-producing core bacteria in northern Huangjiu fermentation[J].AMB Express,2022,12:79.
[10]张超，刘双平，邹慧君，等.黄酒发酵过程中微生物筛选及菌株产香分析[J].食品工业科技，2018，39（14）：94-102.
[11]张宸瑞，高瑞杰，缪礼鸿，等.高产酸扣囊复膜酵母的筛选与培养基配方优化[J].中国酿造，2021，40（7）：153-159.
[12]王奇盛.异常威克汉姆酵母的筛选及其对米酒发酵的风味研究[D].武汉：武汉轻工大学，2022.
[13]王乃军，马美荣.扣囊复膜酵母在白酒生产中的应用研究进展[J].酿酒科技，2023（3）：115-119.
[14]石馨，惠明，田青，等.异常威客汉姆酵母产酯酶培养基优化及发酵液香气物质分析[J].发酵科技通讯，2021，50（3）：149-155.
[15]杜丹，解修超，李新生，等.黄酒酒曲微生物及其代谢产物的研究进展[J].生物资源，2019，41（2）：104-111.
[16]YUAN Y J, YANG Z Y, LIANG Z H, et al.The regulatory effects of microbial community on the formation of higher alcohols and volatile flavor components in Hongqu rice wine brewing[J].Food Biosci,2023,56:103142.
[17]郑楠.低产高级醇酿酒酵母菌株的构建及应用研究[D].天津：天津科技大学，2019.
[18]马博文.黄酒酿酒酵母对醇类物质的代谢调控研究进展[J].酿酒科技，2023（10）：82-88.
[19]LI P,LI T,ZHANG C Y,et al.Effect of ILV2 deletion and ILV3 or/and ILV5 overexpression in Saccharomyces uvarum on diacetyl and higher alcohols metabolism during wine fermentation[J].Eur Food Res Technol,2020,246(3):563-572.
[20]周佳冰，张雅卿，刘双平，等.黄酒酵母在黄酒发酵过程中产芳香醇差异分析[J].酿酒科技，2020（10）：30-37.
[21]李园子，郭慧敏，田伏锦，等.酒中高级醇调控的研究进展[J].食品研究与开发，2024，45（1）：160-169.
[22]吴丹丽，李高磊，王明月，等.低产尿素与高级醇黄酒酵母菌株的筛选、鉴定与发酵[J].食品科学，2019，40（6）：100-105.
[23]汪晗，高瑞杰，杨团元，等.白酒酿造中低产高级醇酿酒酵母的筛选及应用研究[J].中国酿造，2023，42（8）：78-83.
[24]张小龙，王嘉瑞，李青卓，等.合成微生物群落及在发酵食品中应用研究进展[J].中国酿造，2021，40（3）：17-21.
[25]魏浩林，周金虎，刘凤春，等.糯米甜酒曲根霉的筛选及强化曲的研究[J].中国酿造，2017，36（9）：41-44.
[26]国家市场监督管理总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 13662—2018 黄酒[S].北京：中国标准出版社，2018.
[27]王奇盛，高瑞杰，缪礼鸿，等.酵母菌混合发酵制备米酒及其工艺优化[J].中国酿造，2022，41（7）：155-161.
[28]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.7—2016 食品安全国家标准食品中还原糖的测定[S].北京：中国标准出版，2016.
[29]中华人民共和国国家卫生健康委员会.国家市场监督管理总局.GB 12456—2021 食品安全国家标准食品中总酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2021.
[30]陈明举，周迪，王鸿，等.基于GC-MS的浓香型白酒等级评判模型研究[J].中国酿造，2021，40（10）：102-107.
[31]吴卫宇，苏占元，杨晓军，等.测定白酒中挥发性风味成分方法的研究[J].酿酒科技，2018（6）：34-46.
[32]郑杨.芝麻香型白酒关键香气成分研究[D].广州：华南理工大学，2018.
[33]国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会.GB/T 10345—2022白酒分析方法[S].北京：中国标准出版社，2022.
[34]崔荣荣，刘学礼，乔赫梁，等.鲁氏结合酵母与酿酒酵母顺序发酵对米酒发酵性能及关键香气物质的影响[J].天津科技大学学报，2024，39（4）：15-25.
[35]彭凯雄，唐群勇，陈晓明.酿酒用生、熟大米挥发性风味物质差异分析[J].中国食品学报，2023，23（11）：303-319.
[36]陈文颖，周世水，闫统帅，等.基于GC/HPLC检测和苦味评定解析黄酒苦味[J].中国酿造，2022，41（7）：191-197.
[37]李静静.酵母发酵沙棘饮料生产过程中香气成分和主要代谢物变化研究[D].新疆：石河子大学，2024.
[38]谭桂莉.甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛检测方法探索及方法优化[J].企业科技与发展，2022（5）：32-35.
[39]江伟，伍琳，吕志远，等.基于全二维气相色谱-飞行时间质谱结合多元统计方法解析芝麻香型白酒的风味组分研究[J/OL].食品与发酵工业：1-12.[2024-05-02].https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.038128.
[40]刘真，朱丽霞.5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛的高效液相检测方法[J].食品研究与开发，2019，40（18）：166-170.
[41]彭禹熙，樊双喜，张娅，等.酱香型白酒中2,3-丁二酮气相色谱检测方法研究[J].酿酒科技，2024（3）：108-112，117.
[42]向敏，徐茂，王子涵，等.混合乳酸菌发酵对桑叶中挥发性关键异味组分的影响[J].食品与发酵工业，2020，46（20）：241-248.
[43]谢再斌，王太玉，王茜，等.异常威克汉姆酵母在白酒酿造中的应用研究[J].中国酿造，2022，41（5）：18-22.
[44]SUN N, GAO Z Y, LI S Q, et al.Assessment of chemical constitution and aroma properties of kiwi wines obtained from pure and mixed fermentation with Wickerhamomyces anomalus and Saccharomyces cerevisiae[J].Sci Food Agr,2022,102(1):175-184.
[45]WANG Y,QI X Y,FU Y,et al.Effects of Torulaspora delbrueckii cofermented with Saccharomyces cerevisiae on physicochemical and aromatic profiles of blueberry fermented beverage[J].Food Chem, 2023, 409:135284.
[46]鲁振东，谢广发，吴殿辉，等.酒类中苦味物质研究进展及对我国黄酒的借鉴[J].食品与发酵工业，2023，49（7）：309-315.
[47]郭小雨，李梦丽，张涛.百香果发酵型果酒制备及其风味品质分析[J].食品工业科技，2024，45（20）：290-299.
[48]VERSTER J C,VAN DE LOO A J A E,BENSEN S,et al.The assessment of overall hangover severity[J].J Clin Med,2020,9(3):786.
[49]NIU Y W, WANG P P, XIAO Z B, et al.Evaluation of the perceptual interaction among ester aroma compounds in cherry wines by GC-MS,GC-O,odor threshold and sensory analysis: an insight at the molecular level[J].Food Chem,2019,275:143-153.
[50]桂江平，于化泓，余勃，等.基于GC-MS江西米酒风味物质的分析及品质比较[J].中国酿造，2023，42（1）：231-237.
[51]贾志鑫，潘明霞，刘力榕，等.基于代谢组学的速效救心丸抗心肌缺血作用机制研究[J].中草药，2022，53（15）：4719-4729.
[52]史娟兰，奉容，高伟城，等.柱前衍生-高效液相色谱法测定巴戟天中氨基酸含量及营养价值评价[J].食品与发酵工业，2024，50（12）：308-318.
[53]谢静茹.传统绍兴酒关键苦味物质及其影响因素研究[D].上海：上海应用技术大学，2022.
[54]GUAN C R, YUAN Y, ZHANG W J, et al.Variation of bitter components of the asparagus juices during lactic acid bacteria fermentation[J].Biosci Biotech Bioch,2021,85(11):2300-2310.