泡菜起源于3 100年前商代武丁时期并传承至今，已成为我国重要的传统发酵食品产业之一[1-2]。四川是我国泡菜产业第一大省，在2022年泡菜产值已超600亿元，国内市场占有率超过50%[3]。不同于东北酸菜，四川泡菜中的酸菜是以芥菜（Brassica juncea Coss）类蔬菜作为原料经盐渍后二次发酵或直接坛泡发酵而成[4-5]，其产品占市场份额的70%以上，是制作酸菜鱼、酸菜火锅等特色美食的重要原料。另外，芥菜也因其含有硫代葡萄糖苷、类胡萝卜素和各种酚类化合物等丰富的营养物质而深受消费者的喜爱[6]。然而，市面上生产的酸菜大多使用相同的芥菜品种而使产品同质化，缺乏产品细分特征，不利于产业的进一步发展。
针对此现状，国内外围绕芥菜发酵的工艺流程和芥菜品种两方面进行了大量研究。ZHAO N等[7]针对酸菜工业生产的发酵工艺，明确了较长的盐渍时间能促进酸菜中温和挥发性风味化合物形成，酸菜呈味更酸并且刺激性风味更低。汪姣玲等[8]通过接种乳酸菌并结合添加食盐、保脆剂和糖类等辅料从而有效改善了腌制芥菜的品质和感官评价。同样，原料的差异对酸菜品质也有极大影响[4，9]。罗文珊等[10]对比分析了12个芥菜品种发酵后的微生物含量、品质指标、抗氧化能力、挥发性风味物质和感官评价等，明确了竹冲芥菜的发酵特性优于其他品种。同样，本研究团队在前期的研究中[11]对6个不同变种芥菜进行了相关研究，明确了不同变种的硫苷代谢产物差异与发酵品质特性的相关性。然而，在四川泡菜的发酵工艺下针对不同芥菜品种和变种发酵前后品质和风味感官差异的研究鲜有报道。
基于此，本研究选取2种宽柄芥菜（编号为F22374、F22378）和1种叶瘤芥菜（编号为BC25003）进行自然发酵制备酸菜，采用常规检测方法及色谱分析等技术对发酵前后芥菜的理化指标、有机酸、挥发性风味化合物进行测定，结合偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）比较不同芥菜发酵制备酸菜品质及风味特征的差异，并对发酵后的3种酸菜进行质构测定和感官评价，进而明确不同品种和变种间芥菜制备酸菜品质差异，以期为发酵用高品质芥菜的筛选提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
新鲜的2种宽柄芥菜（Brassica juncea var.latipa）（编号为F22374、F22378）和1种叶瘤芥菜（Brassica juncea var.strumata Tsen et Lee）（编号为BC25003）均种植于四川省成都市新都区四川省农业科学院新都试验基地，成熟后统一采收并在实验室进行发酵；发酵母水：四川成都某泡菜企业。
1.1.2 化学试剂
3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；氢氧化钠（NaOH）、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸（均为分析纯）：成都科隆试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Seven Compact S210型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Synergy HTX多功能型酶标仪：美国Bio Tek公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、HP6890/5973气质联用色谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国Agilent公司；TAXTPlus质构仪：英国Stable Micro System公司；固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美国Supelco公司；Aminex HPX-87H有机酸分析柱（300 mm×7.8 mm）：美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 芥菜发酵制备酸菜
将3种不同的芥菜洗净，切除根部。为了方便入坛，将整颗芥菜沿根部中线切分为2份，放置于30 kg发酵坛中。准备盐度6%的发酵母水，将芥菜与发酵母水混合，在室温（15±2）～（18±2）℃下发酵3月，芥菜与发酵母水的质量比为1∶2，每种芥菜发酵3坛作平行。在发酵开始（0 d）和结束（3月）时进行取样，样品存放于-80 ℃冰箱中进行后续指标的测定。
1.3.2 分析检测
（1）理化指标测定
pH值测定：采用pH计，发酵开始和结束的芥菜样品前处理参考文献[11]；还原糖含量的测定：采用二硝基水杨酸法[12]；总酸含量测定：采用酸碱中和滴定法[13]，发酵开始和结束的芥菜样品前处理参考ZHAO N等[7]的方法进行。
（2）有机酸含量的测定
参考GE L H等[12]的方法进行发酵开始和结束芥菜样品前处理，所得样品提取液经10 000 r/min常温离心10 min后通过0.22 μm滤膜过滤。采用HPLC对有机酸进行测定，色谱条件为：流动相0.004 mol/L的H2SO4溶液，Aminex HPX-87H有机酸分析柱（300 mm×7.8 mm），柱温35 ℃，进样量5 μL，流速0.6 mL/min，检测波长215 nm。
定性定量方法：采用与标样比较保留时间进行定性。采用外标法定量。
（3）质构特性
采用质构分析仪[14]测定发酵芥菜样品的硬度。探头为P2，测前、测中、测后速度均为1.0 mm/s，压缩应变为50%，测试固定距离为20 mm，每个样品测12次并取其平均值。
（4）挥发性风味物质
挥发性风味物质采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）-气相色谱-质谱（GC-MS）联用法进行测定。
样品前处理：取发酵前（0 d）和发酵后（3月）的三种不同芥菜样品各5.0 g置于20 mL顶空瓶中，加入10 μL辛酸甲酯（质量浓度73 μL/mL）作为内标，在50 ℃下平衡15 min，萃取45 min后进行上样检测。
GC-MS条件[15]：HP-5MS UI 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min；自动无分流进样；升温程序：初温40 ℃，先维持5 min，后以4 ℃/min升至100 ℃，最后以6 ℃/min升高至250 ℃，保持10 min；电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，MS传输线和离子源温度均为250 ℃；扫描范围：35～550 m/z。
定性定量分析：使用美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）17.L谱库检索，匹配度＞750的挥发性风味物质进行进一步分析，对比质谱图和标准谱图，结合保留指数和已有文献报道进行挥发性风味物质定性分析，内标法进行半定量[16]。
1.3.5 感官评价
采用定量描述分析法[17]制定的感官评价标准见表1，并按照评分标准对发酵后的芥菜（酸菜）进行感官评价。评价小组成员共10名，男女比例1∶1，成员们从色泽、质地、香气、滋味和综合喜好度5个方面对不同芥菜发酵结束后的酸菜进行感官评价，满分为25分。
表1 酸菜感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Suancai
项目 评价标准 感官评分/分色泽（5分）质地（5分）香气（5分）滋味（5分）综合喜好度（5分）有光泽，色泽黄亮光泽略暗，稍有褐变，色泽略带暗黄光泽极暗淡，呈黄褐色口感脆爽或脆嫩，形态完整口感略粗糙或者绵软，形态基本完整口感难咀嚼或者极软烂浓郁且特征性发酵酸香发酵香较弱，略带异味具有不良气味酸咸味适中，具有鲜味酸味和咸味略不均衡，鲜味较弱具有不良滋味按照整体喜好度进行打分4.0～5.0 2.0～3.9 0～1.9 4.0～5.0 2.0～3.9 0～1.9 4.0～5.0 2.0～3.9 0～1.9 4.0～5.0 2.0～3.9 0～1.9 1.0～5.0
1.3.6 数据处理
采用SPSS 26.0对数据进行方差分析、多重比较（Duncan分析法），P＜0.05表示差异显著；使用Origin 2021绘图；偏最小二乘回归分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）采用SIMCA 14.1软件分析。
2 结果与分析
2.1 不同品种芥菜发酵前后还原糖变化分析
不同芥菜发酵前后还原糖含量测定结果见图1。由图1可知，同为宽柄芥的不同品种F22374和F22378在发酵开始时还原糖含量具有显著差异（P＜0.05），分别为2.61 g/100 g和3.13 g/100 g。茎瘤芥BC25003在发酵开始时还原糖含量（2.85 g/100 g）与两种宽柄芥均无显著差异（P＞0.05）。在发酵3月后，不同品种芥菜发酵的酸菜样品中的还原糖含量较发酵开始时均显著降低（P＜0.05），且在F22374和F22378酸菜样品中均未检出还原糖，表明还原糖已被发酵坛中的微生物消耗殆尽[14]，而BC25003在发酵3月后仍存在微量还原糖（0.05 g/100 g）。结果表明，不同品种芥菜均能进行良好的乳酸发酵并充分消耗代谢还原糖，但不同变种芥菜在发酵时微生物对还原糖的利用效率不同。
图1 不同品种和变种芥菜发酵前后还原糖含量的变化
Fig.1 Changes in reducing sugar contents of different varieties and variation leaf mustard before and after fermentation
不同拉丁字母（a，b）表示同一时间不同样品间差异显著（P＜0.05）；
不同希腊字母（α，β）表示同一样品不同发酵时间之间差异显著（P＜0.05），后同。
2.2 不同品种芥菜发酵前后pH值和总酸变化
发酵芥菜中的乳酸菌通过将糖类物质转化为有机酸，从而形成酸菜的特征感官风味，因此pH值和总酸含量不仅能反应发酵体系中微生物的代谢情况，也与酸菜的感官风味密切相关[18-19]。不同品种芥菜发酵前后pH值和总酸含量测定结果见图2。
图2 不同品种和变种芥菜发酵前后pH值（A）和总酸含量（B）的变化
Fig.2 Changes in pH (A) and total acid content (B) of different varieties and variation leaf mustard before and after fermentation
由图2A可知，3种不同品种芥菜在发酵开始时pH值含量均存在显著差异（P＜0.05），其中BC25003芥菜样品的pH值最高，达到6.38；F22374和F22378芥菜样品的pH值则分别为6.10和6.24。发酵后F22374、F22378和BC25003酸菜样品的pH值较发酵开始显著下降（P＜0.05），分别为3.80、3.75和3.79，其中F22378的pH值显著低于其他两种芥菜（P＜0.05）。由图2B可知，发酵后F22374、F22378和BC25003酸菜样品的总酸含量较发酵开始显著增加（P＜0.05），分别为1.1 g/100 g、1.18 g/100 g和1.21 g/100 g。F22378与BC25003酸菜样品的总酸含量没有差异并显著高于F22374（P＜0.05）。pH值和总酸的变化结果表明3种芥菜中的糖类被发酵微生物充分转化为有机酸，从而增加了酸菜中的总酸含量，降低了pH值。
2.3 不同品种芥菜发酵前后有机酸变化
有机酸是酸菜发酵微生物的主要代谢产物，且乳酸发酵是发酵蔬菜中的典型模式[20]。不同品种芥菜发酵有机酸含量测定结果见图3。由图3A和3B可知，发酵开始时F22378和BC25003芥菜样品中的柠檬酸含量没有差异并且显著高于F22374芥菜样品（P＜0.05）；F22374和BC25003芥菜样品中的苹果酸含量没有差异且显著低于F22378（P＜0.05）。由图3C和3E可知，发酵开始时3种芥菜中的琥珀酸和乙酸含量均呈现显著差异（P＜0.05）。以上结果表明不同品种和变种的新鲜芥菜在有机酸组成上各有差异。由图3D可知，发酵开始时3种芥菜样品中乳酸均未检出，发酵后3种酸菜样品的乳酸含量均显著增加，其中F22374和BC25003酸菜样品中乳酸含量没有差异且显著低于F22378酸菜样品（21.4 g/kg）（P＜0.05）。总体而言，不同品种芥菜在发酵过程中柠檬酸、苹果酸和琥珀酸含量降低而乳酸增加，这可能由于随着乳酸发酵，三羧酸循环过程中一些其他底物如乙偶姻或者双乙酰等物质的生成导致的[21]。值得注意的是，宽柄芥F22374和F22378在发酵3个月后柠檬酸含量降至0，而茎瘤芥BC25003在发酵3个月后柠檬酸还有0.13 g/kg，这表明发酵成熟时BC25003较另外两种宽柄芥更具有有机酸的多样性，这与之前有机酸多样性降低的研究结果不同[7]，可能是由于发酵时间的差异以及品种差异而导致的[11，22]。
图3 不同品种和变种芥菜发酵前后有机酸含量的差异
Fig.3 Differences in organic acid contents of different varieties and variation leaf mustard before and after fermentation
2.4 不同品种芥菜发酵酸菜质构特性
酸菜的质构特性是一项重要的感官特性，很大程度上影响了消费者的接受度[23]。为了明确不同芥菜发酵后其质构特性的差异，对发酵3月后3种酸菜进行硬度测定，结果见图4。由图4可知，3种不同品种芥菜发酵后酸菜的硬度具有显著差异（P＜0.05），其中F22378酸菜样品的硬度最高，达到376.6 g，较BC25003和F22374酸菜样品高23.5%和46.3%，可能是由于该品种芥菜的植物组织结构更加致密。F22374酸菜样品在发酵3月后硬度最低，仅为202.2 g，一方面可能是由于其原料本身组织结构更松散，另一方面可能由于其发酵过程中参与的微生物群落组成具有差异，产生了更多果胶酶和纤维素酶等导致植物组织结构软化的微生物[24]。
图4 不同品种和变种芥菜发酵后硬度的检测结果
Fig.4 Determination results of hardness of different varieties and variation leaf mustard after fermentation
2.5 不同品种芥菜发酵挥发性风味物质差异分析
2.5.1 挥发性风味物质测定结果
本研究采用SPME-GC-MS技术对不同品种芥菜发酵前后挥发性风味化合物进行分析，在发酵前后分别鉴定出60种（包括酯类化合物12种，含氮化合物9种，醇类化合物8种，烯类化合物7种，醛类化合物9种，酮类化合物7种，酸类化合物5种，其他化合物3种）和195种（包括酸类化合物24种，酯类化合物49种，醇类化合物38种，含氮化合物10种，酚类化合物10种，酮类化合物15种，芳香族化合物7种，醛类化合物17种，烯类化合物12种，呋喃类化合物6种，其他化合物7种）挥发性化合物，其种类和含量见图5。
图5 不同品种和变种芥菜发酵前（A）后（B）各类挥发性风味物质比例
Fig.5 Proportions of various volatile flavor compounds in different varieties and variation leaf mustard before (A) and after (B)fermentation
由图5A可知，在发酵开始时不同品种芥菜中主要挥发性风味化合物是酯类物质，在F22374、F22378和BC25003芥菜样品中分别占比74.7%、91.7%和81.9%，与MEI Y等[5]的研究结果一致。不同的是，含氮化合物在F22374芥菜样品中占比达到19.5%，是F22378和BC25003的33倍和10倍，而醇类化合物占比最低（3.9%），较醇类物质占比最高的BC28003芥菜样品（10.9%）低了0.6倍。随着发酵的进行，在发酵后3种芥菜的挥发性风味化合物占比较高的分别为酸类（39.9%～44.4%）、酯类（19.2%～22.5%）和醇类（12.6%～21.1%）化合物。其中，宽柄芥F22374酸菜样品中挥发性化合物的组成比例与发酵前芥菜样品相似，与F22378和BC25003酸菜样品有较大差异。其醇类物质占比最高（21.1%），分别是F22378和BC25003的1.67倍和1.68倍，而芳香族类化合物、醛类化合物和烯类化合物占比最低。
2.5.2 差异性挥发性风味化合物筛选
为了明确不同芥菜在发酵前后挥发性化合物的差异性，对3种不同芥菜发酵前后样品中检测出的挥发性风味物质进行偏最小二乘判别法分析（PLS-DA），通过交叉验证和200次随机重分类进行建模，得分图见图6。由图6可知，其X轴方向解释变量（R2X）为0.991，Y轴方向解释变量（R2Y）为0.984，预测能力（Q2）为0.971，表明模型稳定可靠[25]。3种芥菜在发酵开始时具有较好的区分度，其中F22374芥菜样品明显区别于F22378和BC25003芥菜样品，与第二主成分呈正相关。在发酵后所有酸菜样品均聚合在X轴的负半轴，与第一主成分呈明显负相关，这也表明随着发酵进行不同芥菜的风味物质的差异会逐渐减小，这与本课题组前期的研究结果一致[11]。发酵3月后F22378和BC25003酸菜样品聚在一起，与F22374的酸菜样品有一定区分度。
图6 不同品种和变种芥菜发酵前后挥发性风味物质偏最小二乘判别法分析
Fig.6 Partial least squares discriminant analysis of volatile flavor compounds of different varieties and variation leaf mustard before and after fermentation
变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献度，VIP值越大，认为变量在不同品种间差异越显著。以VIP＞1.0为筛选标准，并在发酵前后两个模型中分别鉴定出8种和32种VIP＞1.0的差异挥发性风味化合物，这些物质在3个样品中的含量及显著性差异见表2。由表2可知，在发酵前3种芥菜样品的8种差异性挥发性风味物质中，有5种均为芥菜中的硫代葡萄糖苷类物质经黑芥子酶催化水解产生的异硫氰酸酯类、硫氰酸酯类以及睛类挥发性化合物[26-27]。其中异硫氰酸酯类化合物是芥菜中辛辣、刺激气味的主要贡献物[5]。F22378芥菜样品的异硫氰酸酯和2-苯基乙基异硫代氰酸酯的含量显著高于F22374和BC25003芥菜样品（P＜0.05），而在后两者中这类物质的含量无显著差异（P＞0.05）。有研究表明，烯丙基腈呈辛辣刺激及金属的气味[28]，这类物质在F22374和BC25003芥菜样品中含量更高；而苯代丙腈则呈现出花香[5]，这类化合物在BC25003芥菜样品中含量较F22378和F22374芥菜样品高了2.9倍和7.6倍。
表2 不同品种和变种芥菜发酵前后差异挥发性风味化合物分析
Table 2 Analysis of differential volatile flavor compounds of different varieties and variation leaf mustard before and after fermentation
序号 差异挥发性风味化合物F22374 F22378 BC25003 VIP值含量/（μg·kg-1）发酵前1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26异硫氰酸烯丙酯2-苯基乙基异硫代氰酸酯硫氰酸烯丙酯2-已烯醛叶醇烯丙基腈1,3-二氧杂烷-2-甲醇苯代丙腈醋酸辛酸对苯二甲酸丁基-2-苯氧基乙酯苯代丙腈α-苯乙醇山梨酸辛醇双戊烯2-丁烯腈己酸苯乙醇异硫氰酸烯丙酯2,7-辛二烯-1-醇DL-2-己酸乙酯L（-）-乳酸乙酯辛酸乙酯2-乙基己醇乙酸乙酯正丁醇2-苯基乙基异硫代氰酸酯烯丙基腈异戊醇2-羟基丙酸乙酯2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇2-十一烯醛反-2-辛烯醛30 483±2 476b 990±164b——717±159b 198±80a—36±4c 221±80b 1.92±0.18b 145±9a 55±21b 0.66±0.09c——5.19±0.94b 62±14a 26±11b——20±4c—4.50±0.58c——2.70±0.43b 37±14a—30±1a 1.52±0.38b——58 310±4 157a 4 938±1 546a 980±55a 941±179a 2 293±555a——95±5b 408±28a 4.09±0.23b—161±14a 100±5a 22±0a 3.75±0.07b 18±1a 64±6a 6.90±0.10b—47±5a——43±2a—18±2a 18±3b 7.92±0.78a 10±2a—11±10ab——3.78±0.36b 5.62±0.41a发27 142±6 888b 2 501±612b—822±177a 1 799±231a 326±108a 283±99a 274±48a酵后468±68a 43±8a—131±13a 78±4b 1.82±0.35b 23±2a—62±1a 20±2a—31±1b 12±5a 11±2a 30±3b 9.02±1.37a 7.92±0.45b 27±2a—2.58±0.25b—21±2a—5.45±0.02a 11±5a—4.62 1.76 1.52 1.31 1.30 1.19 1.06 1.00 3.91 3.27 2.89 2.63 2.49 2.34 2.25 2.24 1.90 1.88 1.87 1.85 1.79 1.73 1.68 1.57 1.53 1.50 1.46 1.45 1.40 1.38 1.31 1.28 1.24 1.24
续表
注：“—”表示未检出；字母不同表示含量差异显著（P＜0.05）。
序号 差异挥发性风味化合物F22374 F22378 BC25003 VIP值含量/（μg·kg-1）27 28 29 30 31 32丁酸反式-2-辛烯-1-醇4-乙基苯酚（E）-2-庚烯-1-al 4-乙基-2-甲氧基苯酚棕榈酸11±3b—6.76±1.60b—39±14b 19±0a 15±0b—22±1a 3.78±0.47b 64±6a—21±2a 5.16±0.42a 27±3a 9.22±2.04a 62±7a—1.23 1.20 1.14 1.10 1.08 1.04
随着发酵的进行，芥菜样品中的主要差异挥发性风味化合物从硫苷水解代谢产物逐渐转变为酸类物质，异硫氰酸酯类化合物含量随着发酵进行逐渐降低。其中VIP值＞3.0的物质有醋酸（刺激性酸味）和辛酸（干酪味）[29]，而这两种物质在发酵后的F22374酸菜样品中显著低于F22378和BC25003酸菜样品（P＜0.05）。F22374酸菜样品中含量显著更高的物质如苯乙醇、2-羟基丙酸乙酯和棕榈酸等分别呈现玫瑰花香、果香和脂肪气味[30-31]。总体而言，发酵后F22374酸菜样品较其他两个样品呈现出更低的刺激性酸味，更具有花果香和脂肪等柔和的气味。
2.6 不同品种芥菜发酵制备酸菜感官评价
不同品种芥菜发酵后酸菜的感官评价结果见图7。
图7 不同品种和变种芥菜发酵制备酸菜感官评价雷达图
Fig.7 Radar map of sensory evaluation of Suancai prepared with different varieties and variation leaf mustard fermentation
由图7可知，3个样品的色泽评分为2.9～3.8分，其中F22378酸菜样品色泽得分为3.6分，BC25003酸菜样品发酵后的色泽最暗沉（2.9分）。不同样品质地评分为3.3～3.7分，其中F22378酸菜样品质地得分最高（3.7分），然而3种酸菜样品均未能达到最高质地评分标准，这可能是由于发酵时间较长导致的[32]。在风味方面，F22374酸菜样品的香气得分（4.0分）高于F22378酸菜样品（3.2分）和BC25003（3.4分），结合挥发性风味物质的结果，表明F22374酸菜样品呈现出更柔和的酸香和更平衡的风味。F22374和BC25003酸菜样品的滋味评分均在4.0分以上，较F22378酸菜样品更高。从综合喜好度评分来看，F22374的得分（4.0分）均高于F22378（3.6分）和BC25003（3.0分）。综合各项得分，F22374酸菜样品的感官评分最高（19.4分）。
3 结论
本研究对不同品种和变种的芥菜进行自然发酵，对发酵前后酸菜的品质指标和感官评价进行了相应分析。结果表明，三种芥菜均进行了完整的乳酸发酵，且发酵过程中糖的消耗、总酸的产生和有机酸组成差异并未表现出明显的品种或变种间的规律。其中F22374发酵结束后总酸含量最低（1.1 g/100 g），综合感官评分最高（19.4分），风味化合物组成中呈刺激性酸味的乙酸含量最低（221 μg/kg），呈现花果味和脂肪等柔和香气的酯类和醇类化合物含量较其他芥菜样品更高。因此，宽柄芥F22374在所有样品中体现出更柔和平衡的风味特性和最佳的感官品质，是更具发酵加工潜力的芥菜品种。
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